鸭丙型肝炎病毒TB Green实时荧光定量PCR方法的建立

鸭丙型肝炎病毒(Duck hepacivirus,DuHCV)是近年来从临床表现为产蛋异常鸭(Anas)群中新发现的一种丙型肝炎病毒.为建立DuHCV的分子生物学检测方法用于该病的流行病学调查并进一步探究其致病机制,本研究根据NCBI数据库中DuHCV参考株(HCL-2株,GenBank No.MK737640.1)的NS5B基因特征,设计特异性引物,建立检测DuHCV的TB Green实时荧光定量PCR方法.结果显示,建立的检测DuHCV的TB Green实时荧光定量PCR方法,灵敏度高,最低检测限为64拷贝/μL;特异性好,与鸭群常见传染病病原均无交叉反应,扩增产物的熔解曲线仅DuHCV出现1个特异性单峰,Tm值为(82.22±0.21)℃;重复性好,组内和组间重复试验变异系数分别为0.13％～0.54％和0.53％～1.12％.利用建立的TB Green实时荧光定量PCR方法和常规逆转录PCR(reverse transcription PCR,RT-PCR)方法同时对103份临床样品进行DuHCV感染的检测,结果显示,RT-PCR方法检出阳性样品8份,阳性率为7.8％;TB Green实时荧光定量PCR方法检出阳性样品11份,阳性率为10.68％,且8份RT-PCR阳性样品经TB Green实时荧光定量PCR方法检测均为阳性,符合率为100％.本研究为后续开展DuHCV感染的分子流行病学调查和致病机理研究提供技术支撑.