ssc-miR-204靶向调控猪小肠上皮细胞中DLG5基因的表达

ssc-miR-204在仔猪(Sus scrofa)感染C型产气荚膜梭菌耐受和易感组中显著差异表达,本研究旨在验证miR-204和Discs大同源物5(discs large homolog 5,DLG5)基因之间的靶向调控关系.利用TargetScan软件预测miR-204与DLG5基因之间的靶向结合位点及保守性;构建DLG5基因3'UTR区野生型及突变型pmirGLO双荧光素酶报告载体,通过荧光素酶活性检测miR-204与DLG5基因之间的靶向关系;进一步在猪小肠上皮细胞(intestine porcine epithelial cells,IPEC-J2)中转染miR-204 mimic和 inhibitor,通过qRT-PCR、Western blot和细胞免疫荧光实验,检测miR-204对DLG5表达的调控.结果表明,miR-204成熟体种子区序列与DLG5基因3'UTR第1 333～1 339位核苷酸序列互补配对,并且在多个物种之间高度保守.通过双酶切和测序鉴定,本研究成功构建pmirGLO-DLG5-3'UTR双荧光素酶报告基因重组载体;荧光素酶活性检测结果显示,miR-204 mimic可以极显著降低DLG5基因的荧光素酶活性(P＜0.01),二者具有靶标关系.qRT-PCR、Western blot和细胞免疫荧光结果显示,转染miR-204 mimic后,可以极显著抑制DLG5的表达水平(P＜0.01);相反,转染miR-204 inhibitor后,DLG5被显著或极显著上调表达(P＜0.05或P＜0.01).miR-204可以靶向结合DLG5基因,miR-204对DLG5的表达具有负调控作用,本研究结果可为进一步在细胞水平验证miR-204和DLG5基因功能提供基础,为miRNAs参与调控C型产气荚膜梭菌性仔猪腹泻提供依据.