卫氏并殖吸虫TPx基因的克隆、表达和免疫学诊断价值

目的 免疫筛选卫氏并殖吸虫成虫cDNA表达文库,克隆并表达卫氏并殖吸虫硫氧还蛋白过氧化物酶(TPx),初步评价其免疫诊断价值.方法 用卫氏并殖吸虫病患者的混合血清筛选卫氏并殖吸虫成虫 λZAP cDNA表达文库,取阳性噬菌体进行克隆、测序和序列比对分析.将TPx基因全长片段和前端截短片段分别克隆至原核表达质粒pET28a(+)中,构建rPwTPx(全长型)和rPwTPx_1(截短型)表达载体.构建的重组蛋白经1 mmol/L的异丙基-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达.使用蛋白抽提剂、溶菌酶和核酸酶裂解表达细菌,用组氨酸标签亲和纯化柱(Ni-NTA树脂)纯化rPwTPx和rPwTPx_1,SDS-PAGE检测重组蛋白的表达情况.以rPwTPx、rPwTPx_1和粗抗原作为检测抗原,间接ELISA法检测36份卫氏并殖吸虫病、15份华支睾吸虫病、15份日本血吸虫病、15份片形吸虫病和15份猪囊尾蚴病的患者血清,以及36份健康人血清,评价该重组蛋白的免疫诊断价值.以健康人血清对照组的平均值加上4个标准差作为阳性判断值.所有数据均采用SAS 9.2软件进行统计学分析.结果 克隆的卫氏并殖吸虫TPx基因,经原核表达、纯化,获得其可溶性重组蛋白rPwTPx和rPwTPx_1,相对分子质量(Mr)分别为25 000和22 000.以rPwTPx作为检测抗原的ELISA检测结果显示,卫氏并殖吸虫病患者、健康者、华支睾吸虫病患者、日本血吸虫病患者、片形吸虫病患者和猪囊尾蚴病患者血清组的吸光度(A450值)分别为0.150±0.092、0.036±0.014、0.043±0.019、0.047±0.013、0.060±0.022和0.048±0.021.卫氏并殖吸虫病患者血清阳性率为58.3％(21/36),36份健康人血清、15份华支睾吸虫病患者血清、15份日本血吸虫病患者血清、15份猪囊尾蚴病患者血清均未检出阳性,15份片形吸虫病患者血清假阳性为2/15.以rPwTPx_1 作为检测抗原 ELISA 检测结果则为0.144±0.092、0.022±0.009、0.027±0.015、0.033±0.022、0.036±0.015和0.032±0.018.卫氏并殖吸虫病患者血清阳性率为88.9％(32/36),健康人血清未检出阳性,15份华支睾吸虫病患者血清仅1份存在交叉反应,15份日本血吸虫病患者血清假阳性为3份,15份片形吸虫病患者和15份猪囊尾蚴病患者血清假阳性均为2份.重组蛋白rPwTPx的ELISA检测敏感性为58.3％,特异性为97.9％,总符合率为87.1％;rPwTPx_1 则分别为88.9％、91.7％、90.9％.rPwTPx_1 敏感性高于 rPwTPx(P＜0.05).以成虫粗抗原为检测抗原的ELISA检测结果显示,36份健康者血清A4450值为0.012,标准差为0.006.敏感性为100％,特异性为83.3％,总符合率为87.9％,与rPwTPx-ELISA和rPwTPx_1-ELISA检测的总符合率差异无统计学意义(P＞0.05).结论 筛选并克隆了卫氏并殖吸虫TPx基因,表达并纯化全长型和截短型两种重组TPx抗原,构建的全长型和截短型重组TPx抗原作为人体卫氏并殖吸虫病的免疫诊断抗原具有一定的诊断意义.