Toll样受体2与异丙肾上腺素诱导的心肌纤维化的相关性研究

目的 探讨Toll样受体2(TLR2)对异丙肾上腺素(ISO)诱导的心功能不全和心肌纤维化的影响,探讨TLR2对ISO诱导的心脏成纤维细胞中自噬的影响及TLR2介导的高迁移率族蛋白1(HMGB1)导致心脏成纤维细胞中的自噬抑制进而导致心肌纤维化的机制.方法 使用雄性C57BL/6及TLR基因敲除小鼠各16只,分成4组,每组各8只,分别为:野生型对照组[WT(Vehicle)]、基因敲除对照组[TLR2-/-(Vehicle)]、野生型给药组(WT+ISO)、基因敲除给药组(TLR2-/-+ISO).WT+ISO组、TLR2-/-+ISO组均通过肩胛皮下注射ISO制备了小鼠的心肌纤维化模型,WT(Vehicle)、TLR2-/-(Vehicle)组相应部位注射生理盐水.查超声心动图了解小鼠心脏功能,H&E染色及天狼猩红染色评估心肌细胞损伤心肌纤维化程度,通过免疫印迹实验来检测心肌自噬相关蛋白哺乳动物雷帕霉素结合位点(mTOR)、p-mTOR、轻链3(LC3)、可溶性及不可溶性p62在成纤维细胞中的表达.通过电镜来观察心脏的超微结果和自噬小体.分离小鼠的心脏成纤维细胞,并用不同浓度的HMGB1刺激心脏成纤维细胞,同时免疫印迹实验来检测α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、I型胶原和自噬标志性蛋白p-mTOR、mTOR、LC3、可溶性及不可溶性p62的表达.HMGB1与TLR2,α-SMA与p62之间的互相作用通过免疫共沉淀和免疫荧光共定位来检测.结果 HE病理结果和电镜结果可见WT+ISO组心肌损伤最重,TLR2-/-+ISO组心肌损伤最轻.天狼星染色可见,WT+ISO组心肌疤痕区胶原积聚较多,TLR2-/-(Vehicle)组则分泌减少,两者比相存在差异(P<0.01).免疫印迹实验证实,WT+ISO组心肌组织中collagen I(I型胶原)的表达与TLR2-/-+ISO组比较明显增加(P<0.05).免疫荧光共定位实验证实,WT+ISO组HMGB1含量增加最明显(P<0.01).免疫印迹检测自噬标志性蛋白的表达:与WT+ISO组可溶性P62增加最显著(P<0.01),P-mTOR和mTOR的比值在WT+ISO组增加最明显(P<0.01),WT+ISO组LC3II/I的比值的减小最明显(P<0.01),此外,与其他组相比,WT+ISO组不可溶性P62堆积最明显,TLR2-/-组较少,存在显著性差异(P<0.01).在电镜下观察心肌细胞中的自噬小体,发现WT+ISO组自噬小体数量明显少于其他组,而TLR2-/-+ISO组自噬小体较野生组显著增加,且差异有统计学意义(P<0.01,P<0.05).结论 TLR2介导细胞外的HMGB1使成纤维细胞内自噬流发生阻塞,使选择性自噬接头蛋白p62堆积,进而使α-SMA的转运及降解受阻,从而导致心肌纤维化.因此,可以将HMGB1作为治疗的靶点.