过表达Bax抑制剂1通过抑制线粒体通透性转换孔开放及细胞凋亡减轻心肌缺血再灌注损伤

目的 探讨过表达Bax抑制剂1(BI-1)基因对缺血再灌注损伤的影响及其相关机制.方法 30只SD大鼠随机分为假手术组、缺血再灌注组(I/R组)、对照的腺病毒载体组(Ad-EGFP组)、过表达BI-1的腺病毒载体组(Ad-BI-1组)、环孢素A(CsA组).建立大鼠心肌缺血再灌注损伤(MIRI)模型后,TTC染色观察各组大鼠心肌梗死面积,TUNEL染色观察心肌细胞凋亡情况,电镜下观察心肌细胞超微结构变化,qRT-PCR检测各组大鼠心肌组织中BI-1 mRNA表达.分离培养乳鼠心肌细胞并按细胞处理方式的不同将其分为对照组、缺氧复氧组(H/R组)、对照的腺病毒载体组(Ad-EGFP组)、过表达BI-1的腺病毒载体组(Ad-BI-1组)、环孢素A(CsA组),免疫荧光法检测BI-1的亚细胞定位,Western blot检测各组细胞中BI-1蛋白表达,Calcein-AM法检测各组心肌细胞线粒体通透性转换孔(MPTP)开放水平;应用Western blot检测凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax、细胞色素C(CytC)及Caspase-3、Caspase-9的表达.结果 缺血再灌注后,与假手术组相比,I/R组、Ad-EGFP组、Ad-BI-1组、CsA组大鼠心肌梗死面积显著增加,心肌细胞凋亡数明显增多,心肌线粒体结构受损显著加重(P＜0.05);而与I/R组或Ad-EGFP组相比,Ad-BI-1组、CsA组大鼠的上述指标明显改善(P＜0.05).qRT-PCR结果显示,与假手术组相比,I/R组、Ad-EGFP组、CsA 组中BI-1 mRNA表达均显著降低,而Ad-BI-1组BI-1 mRNA表达明显增加(P＜0.05).成功分离乳鼠心肌细胞,免疫细胞结果显示BI-1主要定位于心肌细胞内质网;与对照组相比,H/R组、Ad-EGFP组、Ad-BI-1组及CsA组的Calcein-AM荧光强度显著降低(P＜0.05),而Ad-BI-1组及CsA组较H/R组细胞明显增加(P＜0.05);Western blot结果显示,H/R组、Ad-EGFP组、CsA组中BI-1蛋白表达较对照组显著降低(P＜0.05),而Ad-BI-1组BI-1蛋白表达明显增加(P＜0.05).此外,在大鼠心肌组织中,与假手术组相比,I/R组、Ad-EGFP组、Ad-BI-1组与CsA组大鼠的Bcl-2/Bax比值均显著降低(P＜0.05),凋亡蛋白Caspase-3、Caspase-9表达均显著增加(P＜0.05),而Ad-BI-1组及CsA组大鼠的Bcl-2/Bax比值明显高于I/R组(P＜0.05),Caspase-3和Caspase-9蛋白表达亦较I/R组明显降低(P＜0.05).CytC表达结果显示,在心肌组织总蛋白中,与假手术组相比,I/R组、Ad-EGFP组、Ad-BI-1组及CsA组大鼠中CytC表达均显著升高(P＜0.05),且后四组之间差异无统计学意义(P＞0.05);但在心肌细胞线粒体中,I/R组、Ad-EGFP组、Ad-BI-1组及CsA组大鼠的CytC表达均显著降低(P＜0.05),且Ad-BI-1组及CsA组大鼠较I/R组明显增加(P＜0.05).结论 过表达BI-1基因能够缩小MIRI大鼠的心肌梗死面积,减轻心肌细胞的凋亡并改善线粒体结构及功能损伤,其作用机制可能是过表达BI-1通过改变Bcl-2/Bax比值,抑制MPTP的开放,减少细胞CytC的释放,降低凋亡蛋白Caspase-3及Caspase-9的活化而发挥上述作用.