利用可视化CRISPR/Cas9系统获得拟南芥Cas9-free突变体

CRISPR/Cas9是实现基因精准突变的有效工具而被广泛应用到功能基因组学研究中.通常需要在已编辑后代的基因组中剔除此编辑体系,以防Cas9进一步编辑导致复杂的脱靶效应.本研究利用可视化的CRISPR/Cas9基因编辑系统敲除拟南芥AtPAE4基因,测序结果显示AtPAE4在第一个外显子的第478号碱基前面插入了一个碱基A,导致氨基酸的移码突变而提前终止.利用种皮特异启动子控制表达的mCherry荧光蛋白,可以在T1代纯合突变体种子群体中分别鉴定出发荧光和不发荧光的种子家系,抗性筛选及分子检测发现不发荧光家系为Cas9-free的AtPAE4突变家系.对AtPAE4突变体的根、茎、叶进行qPCR分析发现AtPAE4在根、茎、叶上的转录水平均显著下调.这些结果表明可视化CRISPR/Cas9系统在基因编辑后代中可快速鉴定到Cas9-free突变体植株,这有助于为进一步研究靶基因功能而获得背景清晰的编辑材料.