罗非鱼罗湖病毒ORF10蛋白的亚细胞定位及组织表达分析

为了研究罗非鱼罗湖病毒(tilapia lake virus,TiLV) ORF10蛋白的功能,从染病莫桑比克罗非鱼(Oreochromis niloticus)脾脏和肝脏组织中克隆获得TiLV ORF10基因编码序列,并成功构建了荧光定位载体pEGFP-ORF10和重组表达载体pET32a-ORF 10.将荧光定位载体pEGFP-ORF 10转染鲤(Cyprinus carpio)上皮瘤细胞(Epithelioma papulosum cyprinid,EPC),经荧光显微镜观察,在EPC的细胞核中观察到绿色荧光信号,表明该蛋白定位于细胞核中.将重组载体pET32a-ORF 10转化大肠杆菌BL21(DE3)进行目的 融合蛋白表达,聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测表明,His-TiLV ORF 10融合蛋白成功表达并主要存在于上清液中.随后,采用Ni-NTA亲和层析的方法纯化融合蛋白His-TiLV ORF10,以其为抗原多次免疫Balb/C小鼠,制备多克隆抗体.蛋白印迹法(WB)分析显示,制备的抗体可以特异性识别His-TiLVORF10.利用蛋白印迹法进一步对感染TiLV莫桑比克罗非鱼的不同来源组织进行检测,结果显示,TiLV ORF10蛋白在染病莫桑比克罗非鱼肌肉、脾脏、肝脏和肾脏中的表达存在较大差异,其中以肝脏和肾脏组织表达量为最高,脾脏次之,肌肉中表达量最低.本研究为深入了解TiLVORF10蛋白的功能和病毒侵染与致病等机理提供了重要基础.