犬瘟热病毒(CDV) RPA-SYBR GreenⅠ检测方法的建立与应用

为建立一种新型、稳定、可普遍应用的诊断犬瘟热病毒(CDV)的方法,将重组酶聚合酶扩增(recombinase poly-merase amplification,RPA)与SYBR Green Ⅰ相结合,根据CDV N基因序列中同源性相对较高的保守区设计1套标有生物素Biotin的特异性引物和1条标记dSpacer、C3 Spacer的特异性探针,优化反应条件和体系,分析其灵敏性及特异性,最后建立一种可以进行临床应用的,特异性检测CDV的RPA-SYBR Green Ⅰ方法.结果 显示,成功构建检测CDV的RPA-SYBR Green Ⅰ方法,此方法的最佳反应条件为实验人员闭合手掌中孵育10 min,引物与探针的最佳比例为2∶1.该方法的最低检测下限为1×101～1×100 TCID50/mL,能够特异地检测出CDV.应用本方法检测临床样品的结果与ELISA、RT-PCR方法的结果一致.结果 表明,本试验所建立的CDV RPA-SYBR Green Ⅰ检测方法特异性强,灵敏度高,操作简单,可应用于临床.