基于PLD蛋白的伪结核棒状杆菌血清抗体间接ELISA检测方法的建立与应用

为了建立以PLD蛋白为包被抗原的伪结核棒状杆菌(Corynebacterium pseudotuberculosis,Cp)血清抗体间接ELISA检测方法,以原核表达得到的重组PLD蛋白作为包被抗原,并进行特异性、敏感性和重复性试验,以及对临床样本进行检测.结果显示,重组PLD蛋白大小为33 ku,Western-blot检测具有良好反应原性;建立的间接ELISA检测方法最佳抗原包被量为每孔200 ng,血清以1∶200稀释作用1h,酶标二抗以1∶5000稀释作用1h,TMB显色20min,血清阴阳性临界值为0.367.特异性试验表明,建立的ELISA方法对羊布鲁菌、产气荚膜梭菌、羊结核、羊衣原体和小反刍兽疫阳性血清检测结果均为阴性,特异性良好;灵敏性试验表明,当Cp标准阳性血清1∶1280稀释时检测结果仍为阳性,灵敏性良好;重复性试验表明,批内和批间变异系数分别在2.27％?8.89％和2.11％?6.92％,重复性良好.对临床采集的山羊样本进行检测与实际患病情况的符合率为96％,符合率较高.对陕西省不同羊场的643份山羊血清进行检测,Cp阳性率为31％.本研究建立的Cp抗体检测方法为下一步研制Cp抗体ELISA检测试剂盒提供了理论基础.