手工克隆生产猪胚胎关键技术的改进研究

手工克隆(handmade cloning,HMC)是在传统克隆技术的基础上发展出的一种体细胞核移植技术,作为纯手工操作技术,每一步骤的操作细节都影响着HMC的效率及重构胚胎发育能力.本试验针对HMC生产克隆猪胚胎的3个关键步骤:透明带消化、手工切割去核与无透明带重构胚的体外培养展开研究.结果显示,猪卵母细胞透明带以3.3 mg/mL链酶蛋白酶适度消化(10～15s),在切割去核时卵母细胞死亡率显著低于透明带的过度(高于15s)消化,死亡率分别为(3.22±1.08)％和(31.45±2.10)％;当透明带消化时间不足(少于10s),不能被切割去核的猪卵母细胞显著升高,不可切割率分别为(18.25±4.22)％和(0.57±0.40)％.另外,"铡刀式"操作更适用于手工切割去核,其操作要点对成功获得无核半卵及其胞质含量非常重要.HMC无透明带重构胚体外培养时,孔深约250 μm、孔径约300 μm的微孔技术(well of wells,WOWs)有利于克隆胚胎发育.本研究优化了 HMC操作的关键步骤,为提高生产克隆猪胚胎效率奠定了基础.