蜜蜂球囊菌菌丝和孢子中长链非编码RNA的比较及潜在功能分析

[背景]蜜蜂球囊菌(Ascosphaera apis,简称球囊菌)是一种专性侵染蜜蜂幼虫的真菌病原,可引起成年蜜蜂数量和蜂群群势的急剧下降.长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)是一类新近发现的非编码RNA,在表观遗传、细胞周期、剂量补偿等众多生命活动中发挥重要生物学功能.[目的]明确球囊菌菌丝和孢子中lncRNA的数量、种类和表达谱差异,并探究共有lncRNA、特有lncRNA和差异表达lncRNA(differentially expressed lncRNA,DElncRNA)在菌丝与孢子中的潜在功能.[方法]利用基于链特异性建库的lncRNA-seq技术对球囊菌的纯化菌丝(AaM)和纯化孢子(AaS)分别进行测序.根据FPKM(Fragment Per Kilobase of per Million mapped reads)法计算lncRNA在AaM和AaS中的表达水平.通过Venn分析筛选AaM与AaS的共有lncRNA和特有lncRNA.按照P≤0.05且|log2 fold change|≥1的标准筛选AaM vs AaS比较组中的DElncRNA.通过Blast工具将共有lncRNA、特有lncRNA和DElncRNA的上下游基因比对GO和KEGG数据库,以进行功能及通路注释.根据靶向结合关系构建共有lncRNA、特有lncRNA和DElncRNA的竞争性内源RNA(competing endogenous RNA,ceRNA)调控网络并利用Cytoscape软件进行可视化.利用RT-qPCR验证测序数据的可靠性.[结果]AaM和AaS分别测得108614646和105675408条原始读段(raw reads),经严格过滤得到107780032和104621402条有效读段(clean reads),Q20分别为98.76％和98.72％,Q30分别达到95.84％和95.78％.共鉴定到850个lncRNA.AaM和AaS的共有lncRNA为701个,二者的特有lncRNA分别为39和110个.上述共有lncRNA通过顺式作用调控3992个上下游基因,它们涉及细胞进程、代谢进程和催化活性等42个功能条目,以及代谢途径、次生代谢物的生物合成和抗生素的生物合成等117条通路;AaM的特有lncRNA和AaS的特有lncRNA通过顺式作用分别调控243和672个上下游基因.AaM vs AaS比较组包含的255个DElncRNA通过顺式作用调控1479个上下游基因,它们涉及代谢进程、细胞进程和催化活性等41个功能条目,以及代谢途径、次生代谢产物的生物合成和抗生素的生物合成等107条通路.从共有lncRNA、孢子特有lncRNA和DElncRNA中分别预测到41、5和13个微小RNA(microRNA,miRNA)的前体序列.调控网络分析结果显示,菌丝lncRNA、孢子lncRNA形成较为复杂的ceRNA调控网络;菌丝lncRNA可靶向结合8个miRNA,进而调控77个mRNA;孢子lncRNA可靶向结合7个miRNA,进而调控87个mRNA;2个DElncRNA(TCONS_00008630与TCONS_00009302)可靶向结合miR-4968-y,进而调控10个mRNA.RT-qPCR验证结果显示4个DElncRNA的差异表达趋势与测序结果一致,表明测序数据真实可靠.[结论]共有lncRNA、特有lncRNA和DElncRNA可能通过调控上下游基因的表达,作为miRNA的前体,以及充当ceRNA影响菌丝和孢子的物质和能量代谢、自噬、转录、MAPK信号通路、泛素介导的蛋白水解、蛋白酶体以及次生代谢产物的生物合成等生物学过程,从而调节球囊菌的生长、发育、生殖和致病性.