利用CRISPR/Cas 9系统构建猪PLIN1基因敲除载体及其效率检测

围脂滴蛋白(PLIN1)是具有抑制基础脂解,调节脂肪甘油三酯的储存和水解的蛋白.本试验利用CRISPR/Cas9系统设计了3条能够靶向切割PLIN1基因的sgRNA并构建相应的突变载体.将构建好的质粒转染入PK15细胞,利用嘌呤霉素筛选,富集PLIN1突变细胞,提取各组细胞DNA进行PCR扩增突变区域,通过序列测定在DNA水平确定突变效率.提取各组细胞总RNA及蛋白,分别利用qRT-PCR及Western Blot测定PLIN1 RNA水平和蛋白水平的表达量.结果 表明,各组细胞PLIN1 DNA均检测到突变或缺失,PLIN1-KO1、PLIN1-KO2和PLIN1-KO3突变比率分别为8％、30％和18％,且mRNA及蛋白表达量均有下降,其中PLIN1-KO2突变效率最高,RNA和蛋白表达量与正常组细胞相比分别下降78.26％和74.00％,差异均极显著(P＜0.01).本试验成功构建了PLIN1基因敲除载体,其中PLIN1-KO2载体突变效率最高,为后续研究PLIN1基因对猪肌肉发育、能量代谢及线粒体功能等方面的作用提供科学依据.