基因拷贝数对重组毕赤酵母的牛乳铁蛋白功能片段表达及细胞存活率的影响

为了提高牛乳铁蛋白功能片段(bovine lactoferrin functional fragment,BlfFf)产量,研究了基因拷贝数对重组毕赤酵母蛋白表达及酵母存活率的影响.将未折叠蛋白响应(unfolded protein response,UPR)激活因子基因HAC1、信号肽切割酶基因Kex2导入重组毕赤酵母BlfFfG01,并以核糖体rDNA非转录基因间隔区同源整合的方法结合PTVA(posttransformational vector amplification)法扩增重组菌株的基因拷贝数.利用SDS-PAGE、Western Blot、ELISA及流式细胞术分析多拷贝重组菌株发酵产物.分析表明,重组蛋白产量随着BlfFf基因拷贝数的增加而增加,但并非线性递增.HAC1拷贝数为3的BlfFfG12菌株产量相比单拷贝的BlfFfG10提高了150％,但更高的HAC1基因拷贝数降低了重组蛋白产量.流式细胞术分析显示,发酵末细胞存活率随着重组菌株中BlfFf基因拷贝数增加而下降,而HAC1基因拷贝数增加可一定程度上提高细胞存活率.摇瓶中BlfFf产量最高的BlfFfG12菌株(11拷贝BlfFf、3拷贝HAC1),在5 L罐进行高密度发酵,表达量为133.4 mg/L.BlfFf与HAC1基因拷贝数对重组蛋白产量及细胞存活率影响显著,优化其基因拷贝数可有效增加重组蛋白产量.