敲低MANF对利福平诱导HepG2细胞损伤的影响及机制

目的 探讨敲低中脑星型胶质细胞源性神经生长因子(MANF)对利福平(RFP)诱导HepG2细胞损伤的影响及机制.方法 慢病毒转染技术构建MANF敲低稳转细胞株(MANF Y25)及其对照细胞株(MANF Y07).实验分为4组:MANF Y07+ DMSO组、MANF Y07+ RFP组、MANF Y25+ DMSO组、MANF Y25+RFP组.给予HepG2细胞100μmol/L RFP 24 h后,Western blot和qRT-PCR检测各组细胞MANF及未折叠蛋白反应(UPR)相关基因葡萄糖调节蛋白78 (GRP78)、蛋白酶R样内质网激酶(PERK)、真核翻译启动因子2α(eIF2α)、活化转录因子4(ATF4)、CCAAT/增强子结合蛋白(CHOP)、Tribbles同源蛋白3(TRIB3)、肌醇需求激酶1(IRE1)、剪接型X-盒结合蛋白1(XBP1-S)、非剪接型X-盒结合蛋白1(XBP1-U)、活化转录因子6(ATF6)的蛋白及基因表达水平;Annexin V-PE/7-AAD双染法检测各组细胞凋亡率;CCK-8法检测各组细胞增殖变化;试剂盒检测各组细胞培养上清液中细胞损伤标志物谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、碱性磷酸酶(AKP)、总胆红素(TBIL)、间接胆红素(IBIL)相对含量变化.结果 在蛋白水平,RFP激活MANF、GRP78、p-eIF2α、ATF4、ATF6的蛋白表达;在基因水平,RFP诱导HepG2细胞MANF、GRP78、PERK、eIF2α、ATF4、CHOP、TRIB3的基因表达,并且MANF敲低后GRP78、p-PERK、p-eIF2α、ATF4、ATF6蛋白表达水平及上述UPR相关基因的基因表达水平进一步上调(P＜0.05),MANF敲低后细胞凋亡率升高(P＜0.01),细胞增殖能力降低(P＜0.01),细胞培养上清液中ALT、AST、AKP、TBIL、IBIL水平升高(P＜0.05),说明细胞损伤加重.结论 RFP可激活UPR,敲低MANF后这种效应进一步加强,同时细胞损伤加重,表明MANF可能通过调节URP而在RFP诱导HepG2细胞损伤中发挥保护作用.