荧光素酶标记的重组人3型腺病毒的构建及分析

人3型腺病毒在人DSG2受体转基因鼠体内复制及侵染等生命过程尚不清楚.本研究旨在构建含萤火虫荧光素酶(Firefly luciferase,Fluc)报告基因的复制型重组人3型腺病毒,为可视化重组人3型腺病毒的应用奠定基础.通过PCR扩增萤火虫荧光素酶报告基因,克隆入去掉EGFP基因的人3型腺病毒穿梭质粒pSKA3E3LR(EGFP),经双酶切后与人3型腺病毒骨架质粒pBRAd3-EGFP的PCR扩增片段经重组酶Exnase体外重组的方法,得到中间载体,最后与pBRAd3-EGFP酶切片段连接,得到重组腺病毒质粒pAd3-LUC;转染AD293细胞,将包装成功的重组腺病毒rAd3-LUC纯化并免疫动物,分析重组腺病毒的特性和在小鼠体内的免疫反应.结果 显示采用体外重组、酶切连接等方法成功获得到重组人3型腺病毒质粒pAd3-LUC,线性化的pAd3-LUC转染AD293细胞包装拯救得到重组腺病毒rAd3-LUC,观察到细胞病变和检测到荧光素酶的稳定表达,rAd3-LUC免疫小鼠抗血清可以识别并中和重组腺病毒rAd3-LUC(滴度约128～256).本研究成功构建了E3区缺失并嵌入荧光素酶的复制型重组人3型腺病毒rAd3-LUC,为监控人3型腺病毒在人DSG2受体转基因小鼠体内复制及侵染等生命过程奠定基础.