源于解淀粉芽胞杆菌酚酸脱羧酶的克隆与表达

[背景]酚酸脱羧酶催化分解酚酸产生的4-乙烯基酚类物质可用于食品添加剂及香精香料行业,而酚酸脱羧酶的表达水平相对较低,因此,高水平的酚酸脱羧酶是工业规模生产4-乙烯基酚类物质的先决条件.[目的]克隆解淀粉芽胞杆菌的酚酸脱羧酶基因,实现在大肠杆菌中的高效异源表达,分析酚酸脱羧酶的底物特异性,并对其表达条件进行优化.[方法]通过PCR技术获得酚酸脱羧酶的基因,构建重组基因工程菌,将测序结果与其他酚酸脱羧酶序列进行比对,利用IPTG诱导方法高效表达蛋白.将重组酚酸脱羧酶与4种不同的底物进行反应,设计响应面试验对诱导条件进行优化.[结果]酚酸脱羧酶对对香豆酸、阿魏酸、咖啡酸、芥子酸的比酶活比率为:100∶23.33∶15.39∶10.51.结合与其他酚酸脱羧酶比对结果发现酚酸脱羧酶家族的C末端区域氨基酸序列的变异率最高,这与酚酸脱羧酶的底物特异性和催化机制有关.通过单因素和响应面试验得到酚酸脱羧酶诱导表达的最佳条件为:2×YT培养基,诱导温度30℃,接种量1.78％,诱导时机3.8 h,IPTG 1.25 mmol/L,诱导时间18h,此时预测酶活和实际酶活分别为47.61 IU/mL和47.55 IU/mL.[结论]应用响应面法优化酚酸脱羧酶的诱导表达是可行的,本试验为以后生产稳定、高产的酚酸脱羧酶以及了解其催化机理提供了重要的理论基础.