靶向DNA修复基因ERCC6的shRNA载体构建及干扰效果评价
Genomics and Applied Biology（2018）
摘要
构建靶向ERCC6基因的短发夹RNA (short hairpin RNA,shRNA)真核表达载体,评价其对肺癌细胞ERCC6表达的干扰效果.依据ERCC6基因的核苷酸序列和小干扰RNA的设计原则,设计并合成靶向ERCC6基因的3对ERCC6-shRNAs和1对阴性对照NC-shRNA片段,退火后连接至表达载体pGPU6/GFP/Neo中,重组载体经测序鉴定后转染肺癌SPC-A-1细胞中观察绿色荧光蛋白的表达情况,实时荧光定量PCR和Western blotting方法检测ERCC6基因表达的变化.经测序分析证实,各ERCC6-shRNA的表达载体均构建成功.转染重组质粒48h后的各组细胞均有绿色荧光表达.实时荧光定量PCR和Western blotting表明,相对于阴性对照组,ERCC6-shRNA1、ERCC6-shRNA2、ERCC6-shRNA3三个实验组SPC-A-1细胞中ERCC6基因在mRNA和蛋白水平上的表达均显著降低(p＜0.05),其中ERCC6-shRNA3载体的干扰效果最佳.本研究成功构建并筛选了靶向ERCC6基因的shRNA高效干扰载体,能够有效抑制ER CC6基因在肺癌细胞中的表达,这为进一步研究ERCC6基因与肿瘤发生分子机制和化疗耐药的相关性提供了帮助.
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