应用CRISPR/Cas9技术构建miR-362敲除的95-D肺癌细胞株

目的:运用CRISPR/Cas9基因编辑技术,建立miR-362基因敲除的95-D肺癌细胞株,并研究miR-362在肿瘤中的调控作用.方法:针对人源miR-362基因序列设计gRNA,构建px330-gRNA载体;T7E1 assay确定gRNA的有效性.分别扩增miR-362上下游同源臂序列构建donor载体.利用脂质体将CRISPR系统和donor载体共转至人肺癌细胞系95-D,通过同源重组方法将筛选标志基因整合至基因组中,通过流式分选以及qPCR方法检测筛选出的细胞中miR-362表达水平.利用Transwell分析miR-362对细胞运动能力的影响.结果:与95-D细胞相比,95-D-KnockDown细胞中miR-362表达水平显著降低,且迁移侵袭能力分别下降了53.1％ (P =0.000 6)和48.3％(P=0.0002).结论:利用CRISPR/Cas9系统成功构建了miR-362基因敲除的95-D细胞,miR-362可促进细胞的运动能力,为后续研究miR-362在肿瘤中的作用机制和功能奠定了基础.