基于锁核酸及等位位点特异性扩增技术的KRAS基因突变检测荧光定量PCR方法研究

基于等位位点特异性扩增的原理,设计锁核酸修饰KRAS基因突变特异性扩增引物,结合封阻探针技术,建立检测KRAS基因突变的荧光定量PCR方法.结果发现,锁核酸修饰的引物及探针可显著提高等位位点特异性扩增技术用于复杂样本中的微量基因突变检测的敏感度,该技术检测KRAS基因突变的敏感性可达0.01％～0.1％.进一步用建立的荧光定量PCR方法检测52例结直肠癌患者血浆标本,并用DNA测序法作为对照,同时用健康人血浆标本建立阴性检测结果判读标准,以初步评价该方法应用于循环DNA中KRAS基因突变检测的可行性.结果发现结直肠癌患者KRAS基因突变主要是G12C、G12A和G12R,而且qPCR法的阳性检出率为46.15％,高于DNA测序法(13.46％),阴性结果与DNA测序法的符合率为100％.此外,结直肠癌患者外周血KRAS基因的突变检出率与文献报道组织标本中的突变检出率及常见突变类型基本相符.上述结果说明该方法检测循环肿瘤DNA (circulating tumor DNA,ctDNA)具有较高的可靠性,可以用于肿瘤患者循环血液中KRAS基因突变的检测.