EvaGreen多重荧光RT-PCR结合熔解曲线分析同时检测3种呼吸道病毒

目的 建立能同时检测甲型流感病毒 (Flu-A) 、乙型流感病毒 (Flu-B) 和鼻病毒 (HRV) 的Eva Green多重荧光RT-RCR熔解曲线分析方法.方法 针对Flu-A的M基因、Flu-B的NS1基因、HRV的5'NCR设计检测引物, 并使3个基因扩增产物的解链温度 (Tm值) 相差≥1.5℃.采用Eva Green新型荧光染料, 通过优化反应条件建立一步法多重RT-PCR反应体系.通过与商品化的荧光RT-PCR试剂盒的对照试验, 对新建方法进行性能验证.结果 3种病毒的PCR产物均获得特异性的熔解曲线峰, Tm值范围分别为:Flu-A, 85.085.5℃;Flu-B, 82.583.0℃;HRV, 88.589.5℃, 可以通过Tm值差异明显区分3种病毒.100份临床样本的性能验证显示, 新方法对3种病毒的检测均有较高的灵敏度、特异性和检验效能.结论 针对3种常见呼吸道病毒建立了基于Eva Green结合熔解曲线分析的多重荧光RT-PCR方法.该方法简便实用、成本低廉, 为喘息性疾病的临床诊断和病原谱研究奠定了方法学基础.