弓形虫二氢叶酸还原酶-胸苷酸合成酶-ROP17真核表达载体的构建及ROP17参与自噬的研究

目的 构建刚地弓形虫二氢叶酸还原酶-胸苷酸合成酶(dihydrofolate reductase-thymidylate synthase,DHFR-TS)-棒状体蛋白17真核表达载体pIRES/TgDHFR-TS-TgROP17,将其转染人胚肾细胞(HEK 293T)后观察ROP17对细胞自噬的作用. 方法 以弓形虫速殖子总RNA为模板,逆转录PCR (RT-PCR)扩增DHFR-TS基因片段,克隆至真核表达载体pIRES的多克隆位点B,构建重组质粒pIRES/TgDHFR-TS.经菌液PCR、双酶切和测序鉴定正确后,用脂质体法转染人胚肾细胞(HEK 293T),RT-PCR法和Western blot检测DHFR-TS的表达.以弓形虫速殖子cDNA为模板,PCR获得ROP17,将其引入重组质粒pIRES/TgDHFR-TS的多克隆位点A,构建重组载体pIRES/TgDHFR-TS-TgROP17.重组载体经菌液PCR、双酶切和测序鉴定后转染人胚肾细胞(HEK 293T),对转染细胞血清饥饿诱导,通过Western blot检测自噬标志蛋白LC3-Ⅱ、Beclin-1和P62的表达. 结果 RT-PCR检测显示,从RH株弓形虫速殖子中扩增出约1 809 bp的片段.菌落PCR、双酶切及测序显示工具载体pIRES/TgDHFR-TS构建成功;转染293T细胞后RT-PCR和Western blot转染pIRES/TgDHFR-TS的细胞中有TgDHFR-TS的表达,基因大小为1 809 bp,蛋白相对分子质量约为68×103.菌液PCR、双酶切和测序显示重组载体pIRES/TgDHFR-TS-TgROP17构建成功,转染293T细胞后RT-PCR和Western blot检测转染pIRES/TgDHFR-TS-TgROP17的细胞中有TgROP17的表达,基因大小及蛋白分子质量与预期相符,而转染pIRES/TgDHFR-TS质粒组未见相应基因及蛋白表达.经血清饥饿诱导后,Western blot检测显示随着去血清时间的延长,LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ的转化、Beclin-1蛋白逐渐增加、P62蛋白逐渐减少. 结论 成功构建了工具载体pIRES/TgDHFR-TS和重组载体pIRES/TgDHFR-TS-TgROP17,且能在真核细胞中表达,表达的弓形虫棒状体蛋白17(ROP17)能促进血清饥饿诱导的细胞自噬.