弓形虫profilin抗体体外抗速殖子增殖及保护作用动态观察

目的 探讨弓形虫profilin(TgPRF)抗体对弓形虫体外增殖的影响以及细胞生长和凋亡的动态变化.方法 1)将rTgPRF蛋白背部皮下多点注射免疫新西兰兔4次,末次免疫后10 d心脏采血,ELISA检测抗体效价.2)检测抗体对速殖子的直接杀伤作用,用108个速殖子(RH-GFP)感染小鼠胚胎成纤维细胞20 h后,加入1∶40抗血清以及YO-YO-1死亡探针孵育观察5 h.3)评估TgPRF抗体对速殖子增殖的影响:将3×103细胞/孔接种96孔板并加入6×103个速殖子(RH-GFP),同时分别加入1∶40、1∶80、1∶160稀释的抗血清作为干预组,设空白组(仅培养基)和阴性血清组(1∶40稀释免疫前兔血清),培养72 h并间隔12 h拍照,通过Image pro 6.0软件分析虫体增殖情况.4)采用In-cuCyte ZOOMTM系统对TgPRF抗体干预后的细胞生长和凋亡进行动态监测:设未感染孔为正常对照组和抗血清对照组(加入1∶40抗TgPRF血清).感染孔加入6×103个速殖子(RH),分别在感染时或感染12 h后加入1∶40、1∶80、1∶160抗TgPRF血清作同步干预或延迟干预,空白组及阴性血清组设置如前.各孔均加入caspase3/7凋亡探针继续观察72 h,记录细胞凋亡情况.结果 rTgPRF诱导特异性抗体产生,ELISA检测抗体效价>1∶105.镜下未见TgPRF抗体对速殖子的直接杀伤作用.体外干预试验中,空白组和阴性血清组的相对虫体量在实验结束时分别为24.27±7.78和25.72±4.04,差异无统计学意义(P>0.05),并伴有大量细胞缺失;TgPRF抗体抑制虫体增殖,实验结束时1∶40组、1∶80组和1∶160组相对虫体量分别为6.32±1.10、9.35±1.32和17.88±1.47,抑制率分别为73.5％、61.5％和26.3％,呈剂量-效应关系.同步干预时各干预组均显示通过抑制虫体增殖不同程度地保护细胞,其中1∶40组细胞生长恢复正常,细胞融合度显著高于空白组和阴性血清组(P<0.01);弓形虫诱导细胞凋亡增加,但各感染组间差异无统计学意义(P>0.05).TgPRF抗体延迟干预的保护效果有所降低,但诱导细胞凋亡增强,其中1∶40组细胞凋亡率显著高于空白组和阴性血清组(P<0.05).镜下观察TgPRF抗体干预使凋亡多集中在细胞缺失区域或速殖子增殖区域,而空白组和阴性血清组的凋亡则散布视野.结论 弓形虫TgPRF抗体镜下未见直接杀伤弓形虫,但在体外能抑制弓形虫速殖子增殖并促进感染细胞凋亡.