MERS-CoV S1蛋白的表达及鉴定

目的 真核表达具有天然构象的中东呼吸综合征冠状病毒(MERS-CoV) S1蛋白,并进行免疫反应性鉴定.方法 以pcDNA3.1-S重组质粒为模板,PCR扩增S1基因,连接至pFastBacl质粒,构建重组质粒pFB1-S1.将pFB1-S1转化至DH10Bac感受态中,构建重组杆粒BpFB1-S1,然后转染sf9细胞获得重组杆状病毒rpFB1-S1并连续传代.将第四代rpFB1-S1接种sf9细胞后悬浮培养96 h,取上清,用PEG8000浓缩并进行免疫亲和层析纯化,采用SDS-PAGE和Western blot鉴定其分子质量及免疫反应性;另取感染rpFB1-S1 48 h的sf9细胞进行IFA鉴定. 结果 S1基因PCR扩增产物大小为2 212 bp,与预期相符.重组质粒pFB1-S1经酶切和测序分析鉴定构建正确.重组杆粒BpFB1-S1经PCR鉴定构建正确.IFA试验可见感染rpFB1-S1的sf9细胞出现特异性绿色荧光,即有目的蛋白表达.SDS—PAGE显示纯化的重组S1为单一100×103 (Mr)蛋白条带,Western blot检测该蛋白能被鼠抗S-RBD蛋白单克隆抗体识别. 结论 成功表达了具有免疫反应性的MERS-CoV S1蛋白,为MERS-CoV快速诊断方法的建立及候选疫苗的构建奠定了基础.