单轴、双轴循环拉力对小鼠肌腱源性干细胞肌腱样分化的影响

目的:探讨单轴、双轴循环拉力对小鼠肌腱源性干细胞(TDSCs)分化的影响，为临床肌腱损伤后的康复治疗提供理论基础。方法:取6～8周龄C57BL/6小鼠10只，无菌条件下暴露双侧后腿至脚掌，显微镜下解剖收集小鼠髌腱和跟腱组织块，体外分离培养细胞，观察第3代细胞的形态特点。(1)取传代至第3代的细胞，采用流式细胞术检测间充质干细胞标志物(CD44、CD90、Sca-1)、内皮细胞标志物(CD34、Flk-1)、造血细胞标志物(CD45)，鉴定细胞是否符合TDSCs特点。(2)取传代至第3代的TDSCs进行成骨细胞、软骨细胞和脂肪细胞分化培养，分别采用茜素红、油红和阿尔新蓝染料对培养的三系细胞进行染色，鉴定细胞是否具有多向分化潜能。(3)取传代至第3代的TDSCs接种到硅胶底培养皿上，分为双轴循环拉力组、单轴循环拉力组、对照组3组。双轴循环拉力组细胞使用Flexcell ? FX-4000TM柔性基底拉伸加载系统，单轴循环拉力组细胞使用自制拉伸力生物反应器，对照组细胞无拉力。双轴循环拉力组、单轴循环拉力组施加机械负荷组的参数均设置为0.25 Hz、6%的循环拉力，在培养期间进行机械负荷加载，每天加载8 h，共加载6 d。第6天机械负荷刺激结束后，收集3组细胞进行实时荧光定量PCR (qPCR)，检测肌腱、成骨、脂肪和软骨相关转录因子的表达。 结果:显微镜下观察第3代TDSCs形态一致，呈梭形纤维状。(1)流式细胞技术检测结果显示，间充质干细胞标志物CD44、CD90和Sca-1表达阳性、内皮细胞标志物CD34和Flk-1表达阴性、造血细胞标志物CD45表达阴性，符合TDSCs标记鉴定特点。(2)三系分化细胞检测结果显示，提取的细胞成功分化为成骨细胞、脂肪细胞和软骨细胞，验证了提取的细胞具有向成骨细胞、软骨细胞和脂肪细胞分化的潜能。(3)对照组、单轴循环拉力组、双轴循环拉力组3组间比较，肌腱、成骨、软骨、脂肪相关转录因子的相对表达量差异均有统计学意义( P值均<0.05)。组间两两比较：单轴循环拉力组与对照组比较，肌腱、成骨相关转录因子以及脂肪相关转录因子PPARγ的相对表达均增高，软骨相关转录因子的相对表达均降低，差异均有统计学意义( P值均<0.05)，而脂肪相关转录因子CEB/P的相对表达差异无统计学意义( P>0.05)；双轴循环拉力组与对照组比较，肌腱相关转录因子Scx、Mohawk的相对表达降低，成骨相关转录因子Runx2的相对表达增高、碱性磷酸酶(ALP)的相对表达降低，软骨相关转录因子Sox9相对表达增高、Col2a1的相对表达降低，脂肪相关转录因子的相对表达均增高，差异均有统计学意义( P值均<0.05)；单轴循环拉力组与双轴循环拉力组比较，双轴循环拉力组肌腱相关转录因子Scx、Mohawk、Col1a1的相对表达均降低，成骨相关转录因子ALP的相对表达降低，软骨、脂肪相关转录因子的相对表达均增高，差异均有统计学意义( P值均<0.05)。 结论:单轴循环拉力诱导TDSCs向肌腱细胞、成骨细胞分化，而双轴循环拉力诱导TDSCs向成骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞分化。单轴循环拉力的作用下可以促进体外TDSCs向肌腱细胞分化，有利于肌腱组织的再生和损伤后的修复，为临床肌腱损伤后的康复治疗提供了理论依据。