双荧光素酶报告基因技术验证miR-31对LATS2的靶向调控作用

目的 通过双荧光素酶报告基因技术验证miR-31对大肿瘤抑制因子2(LATS2)的靶向调控作用,观察miR-31在心肌细胞肥大过程中的可能影响.方法 运用Targetscan软件预测大鼠miR-31对LATS2的靶向调控作用;以双荧光素酶报告质粒为工具载体,分别插入人工合成的大鼠LATS2基因野生型3'UTR(LATS2-3'UTR-WT)及突变型3'UTR (LATS2-3'UTR-MU)片段,构建LATS2-3'UTR-WT及LATS2-3'UTR-MU双荧光素酶报告质粒;重组双荧光素酶报告质粒分别与miR-31过表达质粒共转染293T细胞,检测荧光素酶活性并分析miR-31对LATS2的靶向调控作用;血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)诱导体外心肌细胞肥大模型,RT-qPCR检测miR-31、LATS2及心肌细胞肥大基因心房钠尿肽(ANP)、β-肌球蛋白重链(β-M HC)的表达,F肌动蛋白荧光探针观察心肌细胞形态变化.结果 Targetscan软件预测结果显示,大鼠miR-31与LATS2基因3'UTR存在互补结合位点;经酶切及基因测序鉴定,成功构建LATS2-3'UTR-WT及LATS2-3'UTR-M U双荧光素酶报告质粒;与LATS2-3'U TR-MU+miR-31组相比,LA TS2-3'U TR-NC+miRNA-31组荧光素酶活性无明显变化(0.98±0.03 vs.1.00±0.03,P＞0.05),而LATS2-3'UTR-MT+ miR-31组与LATS2-3'UTR-NC+miR-31组相比,荧光素酶活性显著降低(0.74±0.02 vs.1.00±0.03,P＜0.01);AngⅡ诱导48 h后可检测到心肌细胞肥大基因ANP(P＜0.01)及β-M HC表达上调(P＜0.05),心肌细胞肥大过程中miR-31表达显著上调(P＜0.01),LATS2基因明显下调(P＜0.05),96 h后心肌细胞表面积明显增大.结论 miR-31可通过与LATS2基因3'UTR互补结合实现其对LATS2靶向调控作用,miR-31靶向作用LATS2可能参与调控心肌细胞的肥大.