多重酪氨酸激酶受体抑制剂decorin对高糖低氧条件下血-视网膜内屏障的保护作用及机制研究

目的 研究核心蛋白多糖(decorin)对高糖低氧条件下血-视网膜内屏障的保护作用及机制.方法 培养人脐静脉内皮细胞,采用细胞计数试剂盒检测不同浓度decorin对人脐静脉内皮细胞存活率的影响;高糖低氧条件下(25 mmol·L-1右旋葡萄糖+100 μmol·L-1 CoCl2)孵育人脐静脉内皮细胞,通过ELISA检测不同浓度decorin处理后,不同时间点人脐静脉内皮细胞分泌血管内皮生长因子水平.将细胞分为正常对照组(5.5 mmol·L-1右旋葡萄糖)、高糖低氧组(25 mmol·L-1右旋葡萄糖+100 μmol·L-1 CoCl2)、甘露醇对照组(5.5 mmol·L-右旋葡萄糖+ 19.5 mmol·L-1甘露醇)及decorin处理组(25 mmol·L-1右旋葡萄糖+ 100 μmol·L-CoCl2+100 nmol · L-decorin),通过检测跨内皮细胞电阻(transendothelial electrical resistance,TER)、异硫氰酸荧光素标记的右旋糖酐(fluorescein isothiocyanate,FITC-dextran)的渗漏率来评估单层人脐静脉内皮细胞的屏障功能;Western blotting检测内皮细胞间紧密连接蛋白(claudin-5、occludin、ZO-1)及p38丝裂原活化蛋白激酶(p38 mitogen-activated protein kinase,p38 MAPK)的磷酸化水平.结果 细胞计数试剂盒检测发现,10 nmol·L-1、50 nmol·L-、100 nmol·L-1、200nmol·L-1 decorin处理人脐静脉内皮细胞24h后,各组人脐静脉内皮细胞的存活率均大于90％,差异无统计学意义(均为P＞0.05).在接种后14 d,单层人脐静脉内皮细胞的TER达到最大值且趋于稳定为(170.67±9.07)Ω.与正常对照组比较,高糖低氧处理48 h后,高糖低氧组的TER显著降低至(97.33±6.11)Ω,而decorin组的TER能够维持在(157.67±11.72)Ω,与高糖低氧组相比,差异有统计学意义(P＜0.05).高糖低氧处理48 h后,高糖低氧组FITC-dextran的渗透性明显增加,488nm处的吸光度值为正常对照组的(2.12±0.07)倍(P＜0.05).加入100 nmol·L-1的decorin处理后,FITC-dextran的渗透性明显减少,吸光度值是正常对照组的(1.16±0.03)倍,与高糖低氧组的差异有统计学意义(P＜0.05).高糖低氧处理48 h后,高糖低氧组紧密连接蛋白claudin-5表达量为0.38±0.05、occludin为0.43±0.02及ZO-1为0.25±0.02与正常对照组表达量0.72±0.05、0.90±0.01和0.75±0.02相比,差异均有统计学意义(均为P＜0.05).decorin组claudin-5、occludin及ZO-1表达量分别为0.65 ±0.08、0.87±0.03和0.60±0.01,与高糖低氧组相比,差异均有统计学意义(均为P＜0.05).高糖低氧组p-p38 MAPK/p38 MAPK的比值增加,为0.88±0.02,而decorin组p-p38 MAPK/p38 MAPK的比值(0.58±0.04)接近正常对照组水平(0.56±0.02),与高糖低氧组比较,差异有统计学意义(P＜0.05).结论 decorin能够保护高糖低氧条件下单层人脐静脉内皮细胞的屏障功能并下调p38 MAPK的表达水平,是治疗糖尿病视网膜病变的可能药物.