基于HepaRG活细胞的N-乙酰基转移酶1活性测定方法的建立与评价

目的 建立基于人类肝癌HepaRG活细胞的N-乙酰基转移酶1(NAT1)活性测定方法,并对其测定结果 进行评价.方法 HepaRG细胞用含10％牛血清和青、链霉素培养液进行培养.用免疫印迹技术考察培养24,48和72 h的HepaRG细胞中NAT1表达情况;用噻唑蓝实验测定NAT1底物4-氨基水杨酸(4-ASA)孵育24和48 h对细胞活力的影响,分别用液-质联用技术及免疫印迹技术考察不同浓度4-ASA对HepaRG细胞中NAT1活性及蛋白表达的影响,比较基于HepaRG活细胞的NAT1活性测定方法与传统组织/细胞裂解法对NAT1活性测定结果的影响.结果 与培养24 h的HepaRG细胞相比(0.71±4.00×10-3),培养48和72 h的HepaRG细胞中NAT1的表达量显著增加,分别为(0.80±7.00×10-3)和(1.04±0.04),差异均有统计学意义(均P＜0.05).与对照组相比,浓度为5～100μmol· L-1的4-ASA孵育HepaRG细胞24和48 h,对其活力无明显影响(均P＞0.05);25～100 μmol·L-1的4-ASA孵育HepaRG细胞8h,对NAT1蛋白表达无明显影响(均P＞0.05),且50～ 75 μmol·L-1的4-ASA孵育HepaRG细胞,培养液中4-ASA代谢物的生成量与底物浓度成正比.NAT1活性测定结果显示,HepaRG活细胞法测得的结果略低于传统的组织/细胞裂解法所测得的结果(P ＜0.05或P＜0.01),但两者的酶促反应趋势比较相似.结论 以4-ASA为反应底物建立的基于HepaRG活细胞的NAT1活性测定方法具有操作简单、结果稳定、可动态检测等优势,有望用于NAT1活性的动态测定及NAT1特异性抑制的高通量筛选.