慢病毒介导shRNA沉默大鼠肝BRL-3A细胞PDZK1对胆管侧膜Bsep表达的影响

目的 构建大鼠PDZK1基因RNA干扰慢病毒载体,并观测其对大鼠BRL-3A细胞PDZK1的基因沉默效应与对胆管侧膜胆盐输出泵(Bsep)的影响.方法 针对大鼠PDZK1基因序列,筛选3个干扰靶点,合成其3对小干扰RNA,将各对siRNA分别转入BRL-3A细胞,采用PCR和Western blot方法从中筛选出最佳siRNA;设计合成针对最佳siRNA序列的shRNA,与载体LV3 (H1/GFP&Puro)连接,共转染293T细胞,包装成介导PDZK1基因沉默的LV3/PDZK1shRNA慢病毒载体;感染BRL-3A细胞,荧光显微镜下观察经感染的BRL-3A细胞的GFP表达情况,在mRNA和蛋白水平检测重组慢病毒LV3/PDZK1 shRNA对BRL-3A细胞的PDZK1基因的沉默效应及对Bsep的影响.结果 筛选到PDZK1基因的最佳干扰靶序列.经酶切与测序结果证实,构建LV3/PDZK1 shRNA慢病毒载体成功.BRL-3A细胞经LV3/PDZK1 shRNA慢病毒感染48 h后,PCR检测PDZK1基因表达极低,Bsep表达较弱;WB检测显示PDZK1、Bsep蛋白表达均极弱.结论 成功构建大鼠PDZK1基因RNA干扰慢病毒载体,该载体能有效沉默BRL3A细胞的PDZK1基因,并抑制胆管侧膜Bsep表达.