热激启动子驱动的真核表达质粒pHSP-shPLK1-GFP的构建与鉴定

目的 构建热激启动子(pHSP)驱动的靶向敲低Polo样蛋白激酶1(PLK1)的真核表达质粒,并观察其对骨肉瘤U2OS细胞增殖的影响.方法 首先合成热休克蛋白HSP70的启动子,克隆至带有绿色荧光蛋白(GFP)标签的真核表达质粒pEGFP-C1中,利用pHSP替换原有的CMV启动子,构建真核表达载体pHSP-GFP;其次,利用RNA干扰技术合成以plk1基因为靶向目标的shRNA,将其定向克隆至真核表达载体pHSP-GFP中形成重组质粒pHSP-shPLK1-GFP;另外设计一组阴性对照质粒pHSP-NC-GFP,最后,利用脂质体Lipo2000转染的方法将质粒转染至U2OS细胞,非热激组细胞正常培养,热激组及阴性对照组细胞42 ℃加热2 h,通过细胞免疫荧光染色实验检测GFP的表达,从而确定pHSP的驱动能力,采用Real-time PCR法检测细胞内plk1的mRNA表达水平,Western blot法检测PLK1蛋白表达水平,MTT法检测重组质粒对U2OS细胞增殖的影响.结果 成功构建了pHSP驱动的真核表达质粒pHSP-shPLK1-GFP;细胞免疫荧光染色实验结果显示pHSP可正常驱动gfp基因的表达,且GFP蛋白定位在胞质中;Real-time PCR结果显示热激组细胞plk1基因表达量明显降低,与非热激组及阴性对照组相比差异有统计学意义(P<0.05);Western blot结果显示热激组细胞PLK1蛋白表达量比非热激组及阴性对照组低(P<0.05);MTT结果显示热激组细胞的增殖活性被明显抑制,与非热激组及阴性对照组相比差异有统计学意义(P<0.05).结论 pHSP驱动的真核表达质粒pHSP-shPLK1-GFP能在U2OS细胞中表达,在42 ℃加热条件下,该重组质粒呈现更强的下调plk1基因表达和抑制增殖作用.