ATP5B原核表达和单克隆抗体的制备及其鉴定

目的:制备高纯度ATP合酶β亚基 (ATP5B) 单克隆抗体并进行鉴定, 为其后续研究奠定基础.方法:应用PCR法扩增ATP5B基因, 克隆入pET28a载体中并转入大肠杆菌BL21 (DE3) .异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷 (IPTG) 诱导蛋白表达并用镍亲和层析柱纯化融合蛋白, SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS-PAGE) 检测蛋白纯度.用纯化的融合蛋白免疫3只雌性Balb/C小鼠, 取小鼠尾静脉血, 间接酶联免疫吸附法 (ELISA法) 检测血清中ATP5B抗体效价.取血清效价最高的免疫小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤SP2/0细胞混合培养建立杂交瘤细胞, 采用间接ELISA法筛选融合细胞并行单克隆化培养, 对阳性细胞进行核型分析.取12周龄Balb/C小鼠, 腹腔注射杂交瘤细胞制备腹水模型, 收集腹水, 间接ELISA法检测效价, SDS-PAGE检测抗体纯度, 应用ELISA法检测抗体亚型.结果:PCR扩增后得到1 455bp的特异性条带, 连接pET28a空载体获得重组pET28a/ATP5B载体.IPTG诱导转化的菌液表达目的蛋白, SDS-PAGE检测, 在相对分子质量为51 000处出现明显的诱导蛋白条带.间接ELISA法检测免疫小鼠静脉血, 血清效价最高达1:64 000.杂交瘤细胞染色体核型分析, 染色体总数约为骨髓瘤细胞与正常小鼠脾细胞之和.采用杂交瘤细胞株制备小鼠腹水, 抗体最高效价为1:240 000, 杂交瘤细胞产生的单克隆抗体的亚型为IgG1.结论:通过克隆、表达和纯化重组蛋白, 成功制备出抗ATP5B蛋白单克隆抗体.