FACSAria Ⅱ分选人肺腺癌A549细胞SP亚群的方法优化

目的·通过优化流式分选人肺癌A549细胞SP亚群方法,提高SP亚群分选纯度并缩短分选时间,以提高分选活率.方法·制备单细胞悬液,不同终浓度维拉帕米孵育及Hoechst33342标记染色,经PI标记检测SP细胞比例.选择最佳染色浓度,100 μm喷嘴,分选速度10 μL/min,用一次分选法(纯度模式)和二次分选法(富集+纯度模式)分选SP细胞和MP细胞,比较分选后纯度和分选用时.通过二次分选法获得SP细胞和MP细胞,分别行Lyso-Tracker Red/Hoechst 33342染色共聚焦观察和成瘤实验.结果·经二次分选法,SP细胞纯度达到99％以上,1×108个细胞分选时间＜5.2 h.共聚焦镜下观察到SP细胞大小与MP细胞无明显差异,MP细胞的溶酶体数量较SP细胞显著增多.Hoechst 33342均能染色,细胞活率不受影响.在小鼠成瘤实验中,SP细胞成瘤体积较MP细胞显著增大.结论·A549肺癌细胞Hoechst33342染色终质量浓度宜用6μg/mL;采用FACSAria Ⅱ对其SP细胞进行二次分选,不仅显著提高SP细胞分选纯度,还大大缩短分选时间,细胞活率不受影响.