双重实时荧光定量PCR检测人维生素D受体的方法学构建

目的 建立单管检测人维生素D受体(VDR)及甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)基因的双重实时荧光定量聚合酶链反应(dual real-time PCR)的方法.方法 以GAPDH基因为内参,采用Primer Premier 5.0软件设计特异性引物及TaqMan探针,进行PCR扩增检测VDR基因.将VDR及GAPDH扩增产物片段纯化后克隆构建成重组质粒,作为定量检测基因表达的标准品,并用于分析该方法的灵敏度和重复性.结果 PCR扩增产物经测序分析证实为VDR及GAPDH特异性片段;该方法检测VDR与GAPDH灵敏度达40拷贝/μL;线性范围为4.00×101~4.00×105拷贝/μL;决定系数R2分别为0.998、0.999;扩增效率E分别为96.10%、85.15%;批内变异系数(CV)分别为0.09%~1.21%、0.35%~0.88%;批间CV分别为0.17%~0.51%、0.51%~2.46%.结论 成功建立了单管检测人VDR及GAPDH的双重实时荧光定量PCR方法,且该方法特异性好、灵敏度高、可快速高通量检测VDR的相对表达量,有效缩短时间,减小实验误差.