稀释剂种类和冻融次数对质粒标准品实时荧光定量PCR检测的影响

目的 探讨稀释剂种类和冻融次数这两种因素对实时荧光定量PCR检测中质粒标准品的影响.方法 分别采用ddH2O和TE缓冲液两种稀释剂将质粒标准品稀释为1×108、1×107、1×106、1×105、1×104拷贝/μl的5个浓度检测液各5份,在冻融1次、5次、10次、15次、20次和25次之后进行实时荧光定量PCR检测,比较其Ct值.结果 ①浓度1×108、1×107、1×106、1×105、1×104拷贝叫时,冻融1次、5次、10次、15次、20次和25次之后,质粒标准品在ddH2O和TE缓冲液两种稀释剂中,实时荧光定量PCR检测Ct值中位数分别为17.46和17.32 (P＞0.05),23.52和23.61 (P＞0.05),26.77和26.37 (P＞0.05),32.73和30.88 (P＜0.05),33.08和31.51 (P＜0.05).②冻融1次、5次、10次、15次、20次和25次,在ddH2O和TE缓冲液中,各浓度标准品Ct值中位数分别如下:1×108拷贝/μl:17.43、17.56、17.45、17.45、17.26、17.94 (P＞0.05)和17.38、17.36、17.47、17.31、17.30、17.62(P＞0.05);1×107拷贝/μl:22.17、23.16、24.12、23.51、23.94、23.89 (P＜0.05)和22.40、24.09、24.07、23.54、23.68、24.05 (P＜0.05);1×106拷贝l:24.66、25.27、26.66、27.29、27.78、27.40 (P＜0.05)和24.92、26.22、26.31、26.59、26.93、26.53 (P＜0.05);1×105拷贝/μtl:29.25、30.66、32.72、32.84、33.27、33.39 (P＜0.05)和29.21、30.10、30.97、30.87、31.72、32.44 (P＜0.05);1×10a拷贝ml:31.05、30.50、32.99、33.21、33.59、33.41 (P＜0.05)和31.22、31.28、31.49、31.52、32.37、32.31 (P＜0.05).结论 相对于ddH2O,质粒标准品选择用TE缓冲液作为稀释剂更稳定.质粒标准品随着冻融次数增多,其稳定性越差,因此要避免反复冻融质粒标准品.