鸡颗粒溶素的原核表达及生物活性分析

为了克隆表达纯化鸡颗粒溶素(chicken granulysin,ChGNLY)并进行活力鉴定.本试验以基因组数据库预测的ChGNLY基因为模板设计引物,对提取的鸡脾脏总RNA进行RT PCR,扩增得到的ChGNLY基因插入pMD-19T载体中并测序.将测序正确的GNLY基因克隆至pGEX-6p-1,构建重组表达质粒pGEX-6p-1-GNLY,并将其转化至感受态BL21,IPTG诱导表达融合蛋白,SDS-PAGE、Western-blotting和蛋白质谱鉴定融合蛋白的正确性.CellTiter-Glo(R) 2.0 Assay检测融合蛋白的生物学活性.另外,对GNLY的分子特性进行了生物信息分析.结果显示,测序结果显示克隆的ChGNLY片段长237 bp,编码79个氨基酸,所表达的融合蛋白相对分子质量约为36 000.重组ChGNLY融合蛋白能特异性与人颗粒溶素抗体发生反应.纯化后的GNLY融合蛋白经CellTiter-Glo(R)2.0Assay检测,发现其具有剂量依赖性的细胞毒活性.系统发生分析显示GNLY可明显分为4个群.结构分析发现,ChGNLY活性区域表面带有大量正电荷,且位点保守.结果表明,本试验利用原核表达系统成功表达了具有生物学活性的ChGNLY,为ChGNLY后续功能的研究奠定理论基础.