应用dsRNA干扰技术对旋毛虫Kazal型丝氨酸蛋白酶抑制剂基因功能的初步研究

为研究旋毛虫Kazal型丝氨酸蛋白酶抑制剂基因的功能,通过电转法将dsRNA导入旋毛虫体内,应用实时荧光定量PCR和Western-blot检测经dsRNA-TsKaSPI电转法处理后肌幼虫TsKaSPI基因转录和表达水平.体外培养观察TsKaSPI基因沉默对肌幼虫存活的影响.将dsRNA导入后的幼虫经口接种小鼠,观察TsKaSPI基因沉默对幼虫存活、发育及雌虫生殖力的影响.实时荧光定量PCR和Western-blot检测结果显示,旋毛虫肌幼虫经30 μg/mL dsRNA电转处理后TsKaSPI基因的转录和表达分别降低63.36％和69.24％ (P＜0.05).TsKaSPI基因在dsRNA-TsKaSPI转入肌幼虫后第1天转录水平明显降低,第2和第3天仍处于较低的水平.PBS组、dseGFP对照组和dsRNA-TsKaSPI处理组的肌幼虫死亡率分别为61％、58％、52％ (P＞0.05).将dsRNA电转处理的肌幼虫接种小鼠后6d肠道成虫和35 d肌幼虫的减虫率分别为36.22％和31.87％.PBS组、dseGFP对照组和dsRNA-TsKaSPI处理组的感染小鼠收集到的雌虫新生幼虫量分别为49.20±5.93、49.40±4.62、50.80±4.32(P＞0.05).结果 表明,dsRNA可明显抑制Kazal型丝氨酸蛋白酶抑制剂基因的转录和表达及幼虫在小鼠体内的存活和发育.