猪丁型冠状病毒TaqMan实时定量RT-PCR检测方法的建立和应用

根据GenBank 中登录的猪丁型冠状病毒(PDCoV)N基因序列在保守区设计合成特异性引物和TaqMan 探针,构建含有PDCoV N基因的重组质粒作为阳性标准品,通过优化各项反应条件,建立了检测PDCoV的TaqMan实时荧光定量RT-PCR方法,并对该方法进行特异性、定量线性范围、敏感性和重复性等试验.结果显示,该方法仅对PDCoV出现特异性扩增反应,与猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、A群猪轮状病毒、猪嵴病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、伪狂犬病病毒、猪瘟病毒及猪细小病毒均无交叉反应.该方法的标准曲线Ct值与2.2×109～2.2×101 copies/ L之间的质粒浓度具有良好的线性关系,标准曲线方程为Ct=-3.539×lgX+38.95,线性相关系数(R2)为1.0,检测下限为2.2 copies/ L.对3个不同浓度 (2.2×102、2.2×104、2.2×106 copies/ L)的pMD18-PDCoV-N进行2次重复检测,每个浓度重复试验的Ct值的变异系数均小于1.0％,表明该方法具有良好的重复性.应用建立的方法对64份广西临床腹泻样品进行检测,结果从其中18份样品中检出PDCoV,样品阳性率为28.1％,说明广西猪群存在PDCoV感染.结果表明,建立的TaqMan 实时荧光定量RT-PCR方法为PDCoV的检测和定量分析提供了一种快速、敏感和特异的技术手段.