猪Cyclin A和CDK2蛋白对猪细小病毒增殖的调控作用

[目的]探究猪细胞周期素Cyclin A(pCyclinA)及其依赖性激酶2(pCDK2)对猪细小病毒(PPV)增殖的调控作用,为开展PPV复制机制研究提供依据.[方法]采用RT-PCR扩增pCyclin和pCDK2基因,克隆至真核表达载体pEGFP-C1中构建重组载体,转染猪睾丸细胞(ST),经新霉素(G418)筛选获得pCyclinA或pCDK2过表达的ST细胞株.设计pCyclinA和pCDK2基因特异性干扰片段(shRNA) CycA894和CDK1163,构建干扰表达载体,转染ST细胞,经G418筛选得到pCyclinA和pCDK2低表达的ST细胞株,实时荧光定量PCR检测其干扰效率.流式细胞术分析pCyclinA和pCDK2过表达和低表达对ST细胞周期的影响.将猪细小病毒NY毒株(PPV-NY)接种过表达和低表达的ST细胞,用免疫过氧化物酶单层细胞染色法(IPMA)检测病毒滴度.[结果]pCyclinA和pCDK2基因的开放阅读框(ORF)分别为1 299和897 bp,构建了重组载体pEGFP-pCyclinA和pEGFP-pCDK2.荧光显微镜观察结果显示,融合蛋白EGFP-pCycA和EGFP-pCDK2分别在过表达细胞株ST-pEGFP-pCyclinA和ST-pEGFP-pCDK2中稳定表达.构建了干扰载体pGPU6-GFP/CycA894、pGPU6-GFP/CDK1163和pGPU6-GFP/-shNC(阴性对照);低表达细胞株ST-pGPU6-GFP/CycA894和ST-pGPU6-GFP/CDK1163中的pCyclinA、pCDK2基因的mRNA表达量均极显著降低(P＜0.01).pCyclinA或CDK2过表达分别极显著或显著降低ST细胞S期的比例(P＜0.01或P＜0.05).pCyclinA低表达能极显著降低ST细胞G0/G1期的比例(P＜0.01)、极显著增加S期和G2/M期的细胞比例(P＜0.01);pCDK2低表达能显著增加ST细胞G0/G1期的比例(P＜0.05),但却显著降低S期的细胞比例(P＜0.05).PPV在过表达细胞株ST-pEGFP-pCyclinA和ST-pEGFP-pCDK2中的滴度均极显著低于对照细胞(P＜0.01).低表达细胞ST-pGPU6-GFP/CycA894中PPV滴度极显著增加(P＜0.01),而ST-pGPU6-GFP/CDK1163中的PPV滴度无显著变化(P＞0.05).[结论]pCyclinA或pCDK2过表达均能抑制PPV增殖;pCyclinA低表达可促进PPV增殖,pCDK2低表达对PPV增殖无显著影响;pCyclinA低表达极显著降低G0/G1期细胞比例、但极显著增加S期和G2/M期细胞比例.