NS1基因主要抗原区的可溶性表达及其Dot-ELISA检测方法的建立

[目的]可溶性表达猪流感病毒(SIV) NS1基因主要抗原区(NS1')蛋白,获得具有良好抗原性的NS1'蛋白,并初步建立检测NS1抗体的斑点酶联吸附试验(Dot-ELISA)方法,为鉴别诊断猪流感病毒感染猪与疫苗免疫猪奠定基础.[方法]以质粒pET28a-NS1为模板,PCR扩增NS1基因抗原性较好的区段NS1',用EcoR Ⅰ和XhoⅠ双酶切后插入pET 32a(+),构建pET32a-NS1',经PCR、EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切及DNA测序鉴定后,转化大肠杆菌Rosetta,用IPTG诱导表达,纯化NS1 '并免疫家兔制备多克隆血清,对其进行SDS-PAGE、Western blotting检测和免疫荧光分析,并以纯化的NS1'作为包被抗原初步建立Dot-ELISA检测方法.[结果]PCR扩增获得了长约250 bp的H3N2 SIV NS1'片段;成功构建了重组载体pET32a-NS1';SDS-PAGE和Western blotting检测结果显示,融合蛋白NS1'大小约34 ku,该蛋白可溶,能与感染SIV的猪血清特异性反应,并且用纯化蛋白NS1'制备的多克隆血清能识别293T细胞中表达的NS1,建立的Dot-ELISA检测方法可鉴别猪流感病毒感染猪与疫苗免疫猪.[结论]实现了H3N2 SIV NS1'蛋白的可溶性表达,表达产物具有良好的抗原性,以NS1'作为包被抗原,建立了检测NS1抗体的Dot-ELISA方法.