飞蝗LmGSTS2的酶学特性及其对马拉硫磷、p,p'-DDT的代谢分析

[目的]将飞蝗(Locusta migratoria)谷胱甘肽硫转移酶sigma2(glutathione-S-transferases sigma2,LmGSTS2)在大肠杆菌中原核表达后进行纯化,研究LmGSTS2的酶学特性,并分析其对马拉硫磷和p,p'-DDT的代谢作用.结合飞蝗体内LmGSTs2的RNA干扰及杀虫剂生物学测定,评估LmGSTS2对杀虫剂的代谢解毒能力,为飞蝗抗性治理及合理施药提供理论依据.[方法]将LmGSTS2在BL21 (DE3)中表达,通过Ni-NTA亲和层析对LmGSTS2进行纯化,以CDNB为底物检测LmGSTS2在不同温度和pH条件下的酶活性变化.在最适条件下(pH=7,27℃),用纯化的LmGSTS2蛋白与马拉硫磷和p,p'-DDT进行孵育,通过超高效液相色谱(UPLC)评估LmGSTS2对马拉硫磷和p,p'-DDT的代谢解毒能力.进一步将3μg dsLmGSTs2注入2龄飞蝗若虫体内,24 h后检测目的基因LmGSTs2的沉默效率,并结合杀虫剂生测试验分析飞蝗对杀虫剂敏感度的变化.[结果]将LmGSTS2在大肠杆菌中诱导表达,经SDS-PAGE检测后,发现与两个对照组pET28a/BL21(DE3)和未诱导的pET28a/BL21(DE3)-LmGSTS2相比,诱导后的pET28a/BL21 (DE3)-LmGSTS2总蛋白在25 kD左右出现与目标蛋白大小相符的单一条带,表明LmGSTS2成功表达.对纯化后LmGSTS2蛋白的酶学特性研究结果表明,其最适反应pH范围为6-8,在pH=7时酶活性达到顶峰;最适反应温度范围为25-30℃,27℃时活性最高.在最适条件下,LmGSTS2分别与马拉硫磷和p,p'-DDT进行孵育.UPLC结果显示,与3个对照组相比(GSH+insecticide、active LmGSTS2+insecticide及inactive LmGSTS2+GSH+insecticide),LmGSTS2组马拉硫磷色谱峰面积分别降低83.6％、84.0％和84.6％,差异显著(P＜ 0.05),而p,p'-DDT色谱峰面积与对照组相比无显著变化(P＞0.05),说明LmGSTS2可对马拉硫磷进行代谢,对p,p'-DDT无代谢作用.进一步通过RNA干扰结合杀虫剂生测在飞蝗体内检测LmGSTS2蛋白对马拉硫磷的代谢解毒作用.将靶标基因的双链RNA注入2龄飞蝗若虫体内,24 h后可使飞蝗体内LmGSTs2表达量抑制96％.飞蝗对马拉硫磷的敏感度检测发现,与对照组相比,LmGSTs2基因沉默后飞蝗对马拉硫磷的敏感度增加,死亡率由29.9％上升至45.2％,表明LmGSTS2参与了马拉硫磷在体内的代谢解毒过程.[结论]将LmGSTS2在体外进行表达纯化,并以CDNB为底物检测到该酶最适反应条件为pH=7,27℃左右;对马拉硫磷的体内和体外检测结果显示,LmGSTS2参与马拉硫磷在飞蝗体内的代谢解毒过程;对p,p'-DDT的体外研究结果显示该酶不参与p,p'-DDT的代谢.