甘蓝原生质体制备体系优化及瞬时转化体系的建立

为研究甘露醇浓度、酶解时间、离心力大小和不同外植体对原生质体产量和活力的影响,采用正交试验方案对甘蓝原生质体制备体系进行了优化,并建立了甘蓝原生质体的瞬时转化体系,同时利用该体系对甘蓝CRISPR/Cas9基因编辑系统进行了初步研究.结果表明:以下胚轴为材料,酶液组成为1％纤维素酶+0.5％离析酶+0.6 mol/L甘露醇+10 mmol/L MES+1 mmol/L CaCl2+0.1％BSA+5 mmol/Lβ-巯基乙醇,26℃,60 r/min,黑暗酶解6 h后,用2115 r/min离心5 min收集细胞,可获得高质量的原生质体,原生质体产量约为3.0×106个/g,活力约为90.9％;另外,在20％PEG4000介导下,将带有绿色荧光蛋白的载体(PYBA 1132)分别转入从甘蓝下胚轴、子叶、叶球分离获得的原生质体中,在荧光显微镜下观察到GFP绿色荧光信号,转化效率分别为43％,35％,19％,表明下胚轴分离获得的原生质体最适于瞬时转化.同时以下胚轴分离获得的原生质体为受体,分别转化线粒体特异表达载体COX和质体特异表达载体969,也观察到了荧光信号,成功建立了甘蓝原生质体瞬时转化体系,为甘蓝功能基因定位与功能分析提供了技术平台.最后,利用该体系对CRISPR/Cas9基因编辑载体(PBSE401-BoPDS)中sgRNA的靶向编辑能力进行了检测,结果显示,靶点1和靶点2附近的序列中有碱基替换和插入,表明该体系能够应用于甘蓝瞬时基因编辑,为甘蓝基因功能研究以及新种质的创制建立了重要的技术平台.