碱性蛋白酶抑制剂lupI-MSSS原核表达载体的构建及其蛋白表达、纯化

低温碱性金属蛋白酶MP是从菌株YS-80-122中提取纯化的,属于沙雷氏蛋白酶家族,与该家族报道的其他酶的结构类似,在MP基因下游有一抑制剂基因lupl,该抑制剂可以完全抑制蛋白酶MP的活性.在野生型抑制剂基因的基础上,通过定点突变将LupI的N端增加Met-Ser-Ser-Ser,命名为LupI-MSSS,通过构建pET28a-lupI-MSSS原核表达载体,转化大肠杆菌BL21 (DE3)并诱导表达,SDS-PAGE凝胶电泳结果表明该蛋白的大小约11 kDa,与预测的蛋白分子量一致.对影响蛋白诱导表达的诱导剂添加时间、诱导温度、异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)浓度、诱导时间4个因素进行优化,并经初步优化得到了其诱导表达的条件为:接种量2％,诱导剂添加时间3h,诱导剂IPTG终浓度0.5 mmol/L,诱导温度为37℃,诱导时间为8h.表达的蛋白依次通过超滤,Superdex 200凝胶过滤层析,Q-Sepharose离子交换层析进行纯化,结果显示目的蛋白纯化倍数为20,比活力为15 720U/mg,活性回收率达60.7％,纯化后的lupI通过高效液相色谱法进行纯度分析,其纯度可达99％以上.