基于Red重组系统的阴沟肠杆菌基因重组技术

目的:开发一种基于Red重组系统的E.cloacae基因重组技术.方法:将Red重组酶基因连接于表达载体形成pSC-MSC-red,将Flp重组酶基因连接于表达载体形成pSC-MSC-flp.以budA基因(编码乙酰乳酸脱羧酶)为例,构建了不同长度同源臂的抗性盒.将这些DNA片段分别转化入携带pSC-MSC-red质粒的E.cloacae进行基因重组.结果:使用同源臂长度为39和100 bp的抗性盒不能得到重组子;同源臂长度为200 bp的抗性盒可以获得重组子E.cloacae AbudA-773,重组效率为6.1CFU/μgDNA;同源臂长度为500 bp时,重组效率提高到131.5 CFU/μg DNA.将表达Flp重组酶的质粒pSC-MSC-flp转化入重组菌株中传代培养成功消除了抗性标记.对重组菌株E.cloacae AbudA进行发酵培养实验,菌株丧失了合成乙偶姻和2,3-丁二醇的能力,表明budA基因被成功敲除.结论:本文建立了一种适用于E.cloacae的基因重组方法.