甜瓜蛋白激酶类基因CmPKC的克隆及原核表达载体的构建

根据已知的甜瓜蛋白激酶类基因CmPKC的部分序列,设计带有酶切位点的引物,采用RT-PCR方法获得该基因的完整cDNA序列,并对其蛋白进行功能预测和理化性质分析;采用实时荧光定量PCR分析不同白粉病抗性材料、不同处理时间点该基因的表达量变化情况:将该基冈完整的ORF连接到原核表达载体pEASY-E1上,转化大肠杆菌(E.coli) BL21 (DE3),通过不同浓度IPTG诱导表达,获得适宜的诱导表达体系,SDS-PAGE检测表达产物.结果表明克隆获得的CmPKC基因长约为2 830 bp,开放阅读框为2 493 bp,编码831个氨基酸.生物信息学预测该蛋白的跨膜区域有4个信号肽;在甜瓜白粉病不同抗性材料上相对表达量变化趋势不同,在抗性材料上表达丰度出现的时间较感病材料早,且在不同材料上相对表达量变化趋势与已报道的一个甜瓜感病相关MLO家族基因一致,推测我们所获得的基因也可能与感病及开花、生长发育基因相关,且属于早期应答基因.该蛋白适宜的诱导体系是100 mg/mL IPTG诱导4h,原核表达产物与预期大小一致,表明该基因能够成功表达,为深入探索该基因的功能提供了研究依据.