大鼠LC3B荧光融合表达载体的构建及在骨肉瘤细胞中的自噬检测应用

目的 构建三种rLC3B融合表达载体,探究其在骨肉瘤细胞中的自噬检测应用.方法 采用PCR扩增大鼠LC3B基因序列,克隆至pEGFP-C1和pmCherry-C1,分别构建pEGFP-rLC3B和pmCherry-rLC3B融合表达载体;随后以pEG-FP-rLC3B为模板经PCR得到EGFP-rLC3B序列,克隆至pmCherry-C 1并构建pmCherry-EGFP-rLC3B融合表达载体.将上述三种质粒转染至U-2OS细胞后,采用饥饿和Rapamycin激活自噬,或Chloroquine和Baf-A1抑制自噬,通过激光共聚焦显微镜观察自噬体和自噬溶酶体的形成.采用Western blot检测Rapamycin、Chloroquine和Baf-A1作用下的内源性LC3B和外源性EGFP-rLC3B、mCherry-rLC3B及mCherry-EGFP-rLC3B,验证外源性rLC3B的正确表达和自噬检测功能;采用Western blot检测游离EGFP表达,从而精确检测细胞内的自噬性降解水平.结果 经酶切鉴定和测序验证:成功构建三种融合表达载体.采用饥饿和Rapamycin激活自噬,或Chloroquine和Baf-A1抑制自噬,并在激光共聚焦显微镜下观察到明显的自噬体或自噬溶酶体.Western blot同时检测到内源LC3B和外源rLC3B的表达,并且游离EGFP蛋白的表达随着饥饿时间增加而明显上调,12h组比对照组增加1.05倍,24 h组比对照组增加1.56倍,显示自噬性降解水平升高.结论 EGFP-rLC3B载体可检测自噬体的形成和反应细胞内的自噬性降解水平;mCherry-rLC3B载体可同时显示自噬体和自噬溶酶体,但不能区分这两者;mCherry-EGFP-rLC3B载体可同时显示和区分自噬体和自噬溶酶体,是检测自噬流的最佳方法.