免疫共沉淀联合液相色谱串联质谱技术应用于精子膜蛋白筛选

目的 为了揭示免疫性不育的机制,研究通过免疫共沉淀联合液相色谱串联二级质谱技术筛选与抗精子抗体(ASA)结合的精子膜蛋白.方法 病例对照研究.选取2015年9至12月在中国人民解放军总医院生殖中心门诊就诊的不明原因不孕症血清标本521份,采用ELISA试剂盒进行ASA阳性血清的筛选,再应用混合抗球蛋白试验对ASA阳性血清进行确认,得到ASA阳性血清标本56份作为疾病组,同时选择在该院临床检验科正常查体的血清ASA阴性的已正常生育过的健康人血清标本31份作为对照组.选取2016年1至4月在中国人民解放军总医院行正常查体男性志愿者精液标本48份,混合后提取精子膜蛋白.进行免疫共沉淀反应,精子膜蛋白分别与ASA阳性血清、ASA阴性血清孵育后,同时加入蛋白A/G(protein A/G)孵育,采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰氨凝胶电泳对免疫沉淀复合物进行分离,切胶酶解后,进行液相色谱串联二级质谱分析,得到相应的蛋白编码.通过UniProt数据库检索查找这些蛋白的名称、生物学功能、细胞定位等信息.结果 筛选出ASA阳性不育患者血清56份(女39例、男17例),ASA阴性正常生育者31例(女17例、男14例).共鉴定出40种相关蛋白,可分为3组蛋白,分别是:仅与正常组血清相结合的蛋白(11种);既与正常组血清结合,也与ASA阳性不育组血清结合的蛋白(14种);仅与ASA阳性不育组血清结合的蛋白(15种).这15种蛋白分别是精子阳离子通道蛋白1,精子阳离子通道蛋白3,精子阳离子通道蛋白4,精子相关抗原9,载脂蛋白A-I,轴丝动力蛋白重链14,多波段多肽-2,精卵融合蛋白4,硫氧还蛋白结构域蛋白2,含有蛋白H的IQ域,含有蛋白F1的IQ域,精子发生相关蛋白5,精子发生相关蛋白5样蛋白1,精子顶体膜相关蛋白1,E3泛素蛋白连接酶RNF114.结论 利用免疫共沉淀联合液相色谱串联二级质谱分析技术筛选出15种免疫性不育相关的候选蛋白,可能对揭示免疫性不育病因有重要意义.