RNA干扰技术对犬小孢子菌PQ-LRP基因沉默的研究

目的 构建犬小孢子菌PQ-LRP基因RNA干扰载体,探讨RNA干扰载体对犬小孢子菌PQ-LRP基因表达的影响.方法 用根癌农杆菌介导的T-DNA插入突变技术,加入多克隆位点,引入潮霉素抗性基因,先后构建PUC-PLULT、PCB309-PLULT载体.应用实时PCR方法检测PCB309-PLULT载体对犬小孢子菌PQ-LRP基因表达的干扰作用.结果 构建了中间载体PUC-PLUT、PUC-PLULT,并通过PCR、基因测序进行鉴定.成功构建了长为8 825 bp的干扰载体PCB309-PLULT,并通过酶切测定为该目的载体;筛选出犬小孢子菌转化子的潮霉素最佳浓度为300 mg/L;用实时定量PCR方法对犬小孢子菌PQ-LRP基因干扰前后表达量进行鉴定:以干扰前PQ-LRP相对表达量1.0为标准,干扰后PQ-LRP相对表达量为0.39,干扰后下调61％.结论 干扰载体PCB309-PLULT可以明显抑制犬小孢子菌PQ-LRP基因的表达.