慢病毒介导短发夹RNA特异性沉默黏蛋白3A表达对肝外胆管癌细胞生长增殖能力的影响

目的 探索慢病毒介导短发夹RNA(shRNA)沉默黏蛋白3A(Muc3A)表达对肝外胆管癌QBC939细胞生长和增殖能力的影响.方法 设计、合成针对Muc3A基因的shRNA干扰序列,重组慢病毒质粒进行包装产生病毒液,测定其滴度.转染肝外胆管癌QBC939细胞,采用最佳药物筛选浓度筛选获得稳定阳性细胞株.将肝外胆管癌QBC939细胞分为三组培养:慢病毒介导shRNA转染细胞(转染组)、空病毒转染细胞(阴性对照组)及未转染细胞(空白对照组).蛋白印记(western blot)检测shRNA对Muc3A基因的沉默效率;MTS法检测细胞生长情况,平板克隆形成实验检测细胞增殖情况,流式细胞仪检测细胞周期变化.结果 成功包装慢病毒,病毒悬液的滴度为1×108 TU/ml;病毒液感染EHCCQBC939细胞,Western blot证实shRNA序列定向插入慢病毒载体质粒中;选择3 μg/ml嘌呤霉素最佳筛选浓度,获得稳定细胞株;Western blot结果分别显示转染组Muc3A表达明显低于阴性对照组与空白对照组(P＜0.05).MTS结果显示转染组细胞OD490nm值均明显低于阴性对照组与空白对照组,差异有统计学意义(P＜0.05);平板克隆形成实验显示转染组平板克隆形成数目明显少于阴性对照组与空白对照组,差异有统计学意义(P＜0.05);流式细胞术分析显示转染组细胞周期处于G2/M较多而S期较少,但与阴性对照组与空白对照组相比差异无统计学意义(P＞0.05).结论 慢病毒介导shRNA转染干扰Muc3A基因表达后可明显抑制肝外胆管癌QBC939细胞的生长增殖和克隆能力,提示Muc3A能促进肝外胆管癌细胞的生长与克隆增殖.