共表达人PUMA和HGF/NK4基因的重组腺病毒的制备及在胰腺癌细胞中的表达

目的 制备同步表达HGF/NK4基因和PUMA基因的重组腺病毒,感染胰腺癌细胞后检测基因的有效表达.方法 将PUMA基因和HGF/NK4基因以串联方式依次克隆至腺病毒穿梭载体,构建重组穿梭载体pAdTrack-PUMA-NK4,转化大肠杆菌BJ5183并在细菌内与腺病毒载体同源重组制备重组腺病毒载体pAd-PUMA-NK4.PacⅠ酶切后转染至HEK293细胞包装得到重组腺病毒.一定滴度的腺病毒感染人胰腺癌细胞株,荧光定量RT-PCR检测细胞中NK4和PUMA基因mRNA表达水平.结果 双酶切重组pAd-PUMA-NK4穿梭载体鉴定证实目的基因PUMA和HGF/NK4正确克隆；重组腺病毒载体经PacⅠ酶切得到特异的酶切产物转染HEK293细胞后成功包装出重组腺病毒；病毒感染胰腺癌细胞后3～9d内PUMA和NK4基因的表达水平较高,整体持续表达可维持2w.结论 成功构建了同时表达NK4和PUMA基因的重组腺病毒载体并包装出相应的重组腺病毒颗粒,该腺病毒能有效感染胰腺癌细胞并高表达NK4和PUMA基因,这为进一步确定NK4和PUMA基因的功能及指导双基因联合治疗胰腺癌提供了理论依据和必要的材料.