晚期内含子 ／溶酶体适配子和促分裂原活化蛋白激酶以及哺乳动物重组雷帕霉素激活物分子 2 基因的 RNA 干扰慢病毒载体的构建及其对巨噬细胞中炎性因子分泌的影响

目的 构建针对晚期内含子／溶酶体适配子和促分裂原活化蛋白激酶以及哺乳动物重组雷帕霉素激活物分子2( late endosomal／lysosomal adaptor, mitogen-activated protein kinase and mammalian target of rapamycin activator 2, lamtor2)基因的小发夹RNA慢病毒载体,探讨RNA干扰lamtor2基因表达后对肺炎克雷伯菌感染引起的巨噬细胞中炎性因子分泌的调控作用.方法 针对小鼠lamtor2基因设计2对小发夹RNA( shlamtor2),重组构建慢病毒载体pLKO.1-puro shlamtor2,并感染小鼠巨噬细胞系RAW264.7细胞.设2个实验组,pLKO.1-puro shlamtor2-1感染组( sh1组)和pLKO.1-puro shlamtor2-2感染组(sh2组),以空载pLKO.1质粒感染RAW264.7细胞为对照组.通过实时定量PCR和蛋白质印迹法检测各组细胞中lamtor2基因表达.肺炎克雷伯菌感染sh2组细胞,采用实时定量PCR方法检测细菌感染后细胞内白细胞介素(interleukin,IL)-1β、IL-6和肿瘤坏死因子( tumor necrosis factor,TNF)-α表达水平的变化. 2组间比较采用t检验.结果 重组慢病毒颗粒pLKO.1-shlamtor2感染RAW 264.7 细胞后,对照组lamtor2基因mRNA相对表达量为1.000 ±0.000,sh1组为0.596 ±0.125,sh2组为0.120 ± 0.080,sh2组的lamtor2表达量低于sh1组,差异有统计学意义(t＝3.399, P＝0.015),且sh1组和sh2组的表达量均低于对照组,差异均有统计学意义(t＝3.333、9.734,均P ＜0.05).以肺炎克雷伯菌感染的野生RAW 264.7细胞作为对照, sh2组细胞感染肺炎克雷伯菌后,细胞中的 IL-1β( t＝15.20)、IL-6 (t＝43.30)和TNF-α(t＝12.67)表达水平均高于对照组(均P＜0.01).结论 针对lamtor2 基因的小发夹RNA可通过RNA干扰机制稳定下调巨噬细胞中lamtor2基因的表达,基因下调对感染了肺炎克雷伯菌的巨噬细胞内的炎性因子的分泌有明显的促进作用.