低氧对小鼠RGC-5细胞中膜联蛋白A2表达的抑制作用

背景 研究已证实,缺氧是诱导视网膜新生血管形成的主要因素,与多种眼科病变的发生有关,且低氧与视网膜神经节细胞(RGCs)的变性也密切关联,但对视网膜神经组织病变的研究较少. 目的 观察低氧对RGCs中ANXA2表达的影响,探讨低氧对RGCs的损伤机制. 方法 用含体积分数10％胎牛血清的高糖培养液对小鼠RGC-5细胞株进行培养,采用免疫荧光技术检测RGCs特异表面抗原Thy-1的表达.分别采用含CoCl2终质量浓度为50、100、200、300 μmol/L的培养液培养RGC-5细胞,并分别于培养后12、24、48 h采用细胞计数试剂盒8(CCK-8)法检测细胞吸光度(4)值,以不含CoCl2培养液培养RGC-5细胞作为正常对照.以含终浓度为100μmol/L CoCl2培养液培养RGC-5细胞以建立低氧细胞模型,将模型细胞分为低氧3h组、低氧6h组、低氧12h组、低氧24 h组,正常培养的细胞作为正常对照组.各组细胞行Hoechst 33342荧光染色,观察RGC-5细胞核形态的变化;采用实时定量逆转录PCR检测各组细胞中ANXA2 mRNA的相对表达量;采用Western blot法检测细胞中ANXA2蛋白的相对表达量;采用免疫荧光法观察ANXA2在细胞中表达的分布. 结果 体外培养的RGC-5细胞呈梭形或多边形,Thy-1反应阳性.与正常对照组比较,50和100 μmol/L CoCl2组各时间点细胞A值的差异均无统计学意义(均P＞0.05);200和300μmol/L CoGl2组各时间点细胞A值均明显低于正常对照组,差异有统计学意义(均P＜0.05).正常对照组细胞核Hoechst 33342染色未见致密的亮蓝色荧光,低氧3h组、低氧6h组、低氧12组和低氧24组细胞核内均可见致密的亮蓝色强荧光.低氧3h组、低氧6h组、低氧12h组和低氧24 h组RGC-5细胞中ANXA2 mRNA的相对表达量分别为0.80±0.14、0.67±0.33、0.49±0.17、0.39±0.02,均明显低于正常对照组,总体比较差异有统计学意义(F=434.354 ,P=0.000).低氧3h、6h、12h、24 h组RGC-5细胞中ANXA2蛋白的相对表达量分别为0.552 6±0.012 3、0.425 9±0.033 4、0.344 9±0.017 8和0.382 7±0.022 1,明显低于正常对照组的0.602 1±0.0014,总体比较差异有统计学意义(F=3.057,P=0.000).免疫荧光结果显示ANXA2蛋白主要在RGC-5细胞核中表达,少量表达于细胞膜及细胞质中,各低氧组细胞质中ANXA2蛋白荧光弱于正常对照组. 结论 低氧条件下小鼠RGC-5细胞中ANXA2表达水平明显下调,可能与高糖环境下RGCs凋亡有关.